De konstante angreb fra den spanske erobrer Don Nuño Beltrán de Guzmán mod landets vestlige lande for at øge hans herredømme og magt over disse territorier resulterede i oprettelsen af en ny provins kaldet Kongeriget Ny Galicien.
Regionen var beboet af forskellige indfødte grupper, der løbende hærgede de bosættelser, som spanierne havde grundlagt i den. Nuño de Guzmáns løjtnant, kaptajn Juan B. de Oñate modtog ordrer til at pacificere disse provinser og at grundlægge Villa de Guadalajara på det sted, der hedder Nochistlán, en kendsgerning, at han fuldendte den 5. januar 1532. I lyset af hyppige oprindelige angreb på byen han måtte flytte et år senere til Tonalá og senere til Tlacotlán. En tredje overførsel blev foretaget for at bosætte byen i Atemajac-dalen, hvor byen blev endeligt grundlagt den 14. februar 1542 med tilstedeværelsen af Cristóbal de Oñate som guvernør for Nueva Galicia og Don Antonio de Mendoza, derefter vicekonge i Det nye Spanien, der udnævnte Miguel de Ibarra til borgmester og løjtnant guvernør.
Byen udviklede sig hurtigt og begyndte at konkurrere med Compostela (i dag Tepic), som dengang var sæde for religiøse og civile magter, så indbyggerne i Guadalajara udøvede et sådant pres på Audiencia-myndighederne, at kongen Felipe II besluttede at udstede et certifikat dateret 10. maj 1560 for at flytte fra Compostela til Guadalajara, katedralen, Royal Court og Treasury embedsmænd.
Bystrukturen blev planlagt i overensstemmelse med de andre koloniale byers, så dens layout blev udviklet i form af et skakbræt fra det, der var San Fernando-pladsen. Senere blev kvartererne Mexicaltzingo og Analco etableret af Fray Antonio de Segovia og kvarteret Mezquitán, en af de ældste. Rådhushuse blev også bygget foran det nuværende San Agustín-tempel og den første sognekirke, hvor Justitspaladset ligger.
I dag udviser den storslåede by, frodig i koloniale bygninger, et stort antal relevante arkitektoniske eksempler, såsom dens katedral, et must-see sted, bygget mellem 1561 og 1618 af arkitekten Martín Casillas. Hans stil er blevet klassificeret som begyndende barok. Dens solide struktur stiger foran den i dag Plaza de Guadalajara med sine nysgerrige tårne, der, selvom de ikke hører til bygningens originale stil, i øjeblikket anerkendes som et symbol på hovedstaden i Guadalajara. De primitive tårne blev ødelagt i det 19. århundrede af et jordskælv, hvorfor de blev tilføjet i dag. Det indre af templet er halvgotisk i stil, herunder dets hvælvinger, der er lavet af blonder.
Andre religiøse distrikter fra det 16. århundrede er San Francisco-klosteret, der blev oprettet i 1542 nær floden, i kvarteret Analco og næsten totalt ødelagt i reformationen. Dets tempel, der blev renoveret i slutningen af det 17. århundrede med sin barokke facade af beskedne solomoniske linjer, er bevaret. Klosteret San Agustín, blev grundlagt i 1573 af den kongelige ordinance af Felipe II og bevarer i øjeblikket sit tempel med sin facade af svære herreriske linjer og dets indre med ribbet hvælvinger.
Santa María de Gracia, en anden af de konventuelle fundamenter, blev besat af dominikanske nonner fra Puebla, bygget i 1590 foran Plaza de San Agustín og betalt af Hernán Gómez de la Peña. Konstruktionen kom til at indtage seks blokke, skønt i dag kun dets tempel vedvarer, med en neoklassisk facade fra anden halvdel af det 18. århundrede.
